一． 蛋白樣品的制備
按組織凈重（g）：裂解液體積（ml）=1:10 的比例加入相應(yīng)體積的裂解液（加入終濃度為 1mM 的 PMSF，適當(dāng)濃度的蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑，以避免內(nèi)源性酶分解蛋白， 影響蛋白質(zhì)的抽提）進(jìn)行勻漿。
蛋白質(zhì)的樣品制備是 western blotting 的第一步，也是關(guān)鍵步驟，要求可獲得所有蛋白 質(zhì)，應(yīng)注意以下問(wèn)題：
（1） 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。
（2） 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià) 二硫鍵，使其形成各自多肽的溶液。
（3） 盡量去除核酸，多糖，脂類(lèi)等分子的干擾，在裂解完畢離心之后小心取中層澄 清溶液，注意不要吸到底層沉淀和上層脂類(lèi)。
（4） 防止蛋白在處理過(guò)程中的人為修飾，制備過(guò)程必須在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞 破碎釋放出各種酶類(lèi)的修飾。（可以加入 PMSF 等酶抑制劑）
（5） 樣本制備完后分裝保存，但是注意不要反復(fù)凍融
二． 凝膠的制備
均一膠的制備，分子量較小的蛋白選用較大濃度的凝膠。
30%的 PAG 配置完后過(guò)濾于 4℃保存。10%SDS 室溫保存。AP 不穩(wěn)定，用時(shí)現(xiàn)配。
制膠關(guān)鍵是聚合時(shí)間，分離膠聚合控制在從加入 10%AP 和 TEMED 至開(kāi)始凝膠,時(shí)間 為 10-20min（未完全凝聚）。濃縮膠最佳聚合時(shí)間為 8-10min。可通過(guò)控制 AP 和 TEMED 量來(lái)控制。AP，TEMED 的量過(guò)高，局部膠凝的太快，會(huì)使凝膠不均勻，電泳蛋白條帶會(huì) 彎曲。環(huán)境溫度較高時(shí)，應(yīng)減少 AP，TEMED 的量。 空氣中氧氣也會(huì)影響膠的聚合，所以 在分離膠上面應(yīng)加一層水或正丁醇以隔絕氧氣。
三． 電泳常見(jiàn)問(wèn)題：
（1） 條帶出現(xiàn)“微笑”現(xiàn)象（中間凹兩邊翹起）：主要是凝膠中間部分凝固不均所致， 應(yīng)待凝膠充分凝固后電泳，或者催化劑加入后充分混勻。
（2） 條帶出現(xiàn)“皺眉”現(xiàn)象（中間鼓坡兩邊向下）：兩玻璃板之間底部氣泡所致，應(yīng) 排除底部氣泡。
（3） 帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象：主要是樣本溶解效果不佳；分離膠濃度過(guò)大，電泳緩沖液放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。建議：加樣前離心，選擇適當(dāng)?shù)臉颖揪彌_液，加適量的樣品促溶 劑；使用新配置的電泳緩沖液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠。
（4） 蛋白條帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象：樣品不溶性顆粒引起的。建議：加樣前離心，加入適 量的促溶劑。
（5） 指示的溴酚藍(lán)已跑出底板，但蛋白質(zhì)未跑下來(lái)：與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。 應(yīng)更換正確 PH 值的緩沖液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠
四． 轉(zhuǎn)印
濕式電轉(zhuǎn)印注意事項(xiàng)：
（1） 要使蛋白質(zhì)組分能有效的從凝膠轉(zhuǎn)移到固相紙膜上，緩沖液的 PH 值很重要。 有些分子量不是很大的蛋白質(zhì)區(qū)帶，即使延長(zhǎng)電轉(zhuǎn)印時(shí)間也不能從凝膠轉(zhuǎn)移到 膜上。這是由于蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)移緩沖液中恰好處于等電點(diǎn)狀態(tài)造成的，因此應(yīng)適 當(dāng)改變轉(zhuǎn)移緩沖液的 PH，以利于轉(zhuǎn)膜。另外，對(duì)于分子量較小的蛋白質(zhì)，可 在緩沖液中加入適量甲醇，因?yàn)榧状寄艽龠M(jìn)它們固定在固相膜上。但是對(duì)于大 分子量的蛋白質(zhì)，尤其是堿性蛋白質(zhì)，緩沖液中是不宜加入甲醇的，因?yàn)榧状?使凝膠孔徑變小，不利于分子量較大的蛋白的轉(zhuǎn)移，甲醇能將結(jié)合在堿性蛋白 質(zhì)上的 SDS 解離出來(lái)而使其帶正電或呈電中性，蛋白質(zhì)就更難從凝膠中轉(zhuǎn)移出 來(lái)。
（2） 電轉(zhuǎn)印膜的選擇：有 NC 膜，重氮化膜和陽(yáng)離子尼龍膜，PVDF 膜。其中 NC 膜使用的最為普遍，它的蛋白質(zhì)容量大，可用各種染色方法進(jìn)行檢測(cè)，但是它 與蛋白質(zhì)的結(jié)合是非共價(jià)性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔徑大小也是考慮的 重要因素，目的蛋白 30KD 以下用 0.22um 孔徑的 NC 膜，30KD 以上用 0.45um 孔徑的 NC 膜。
（3） 轉(zhuǎn)印選擇恒流，每個(gè)轉(zhuǎn)印槽 150mA,10KD 以下轉(zhuǎn)印 40min，10-30kd 轉(zhuǎn)印 50min， 30-100KD 轉(zhuǎn)印 70min，100kd 以上轉(zhuǎn)印 80min，轉(zhuǎn)印完畢可用麗春紅 S 染膜， 檢測(cè)轉(zhuǎn)印是否成功，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，去除 NC 膜置于麗春紅 S 溶液中，室溫 5-10min 即可看見(jiàn)紅色條帶，用 TBS 洗數(shù)次即可洗掉紅色條帶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
五． 封閉
（1） 電泳轉(zhuǎn)膜過(guò)后，膜上其他沒(méi)有結(jié)合蛋白質(zhì)的空白位置需要用封閉液加以封閉， 以避免一抗或二抗非特異性結(jié)合。這是由于 WB 的靈敏度很大程度上取決于封閉的好壞，封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（過(guò)度封閉）導(dǎo)致抗原表位的遮蔽，從而降低檢測(cè)靈 敏度；封閉時(shí)間過(guò)短（不完全封閉）又會(huì)導(dǎo)致最終背景增高或信噪比太低，因 此封閉液的選擇和條件的優(yōu)化很重要。
（2） 封閉液中應(yīng)加入適量的防腐劑，避免封閉蛋白變性影響封閉效果。
六． 抗體的雜交
（1） 若非特異性條帶過(guò)多，可適當(dāng)降低抗體的濃度，增加洗膜次數(shù)，蛋白電泳前延 長(zhǎng)變性時(shí)間，減少上樣蛋白量，延長(zhǎng)封閉時(shí)間。
（2） 若信號(hào)弱，可能轉(zhuǎn)膜不完全，可優(yōu)化轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，增加抗體的濃度，適當(dāng) 延長(zhǎng)曝光時(shí)間。
（3） 若背景較高，可適當(dāng)降低抗體的濃度，過(guò)濾二抗，延長(zhǎng)封閉時(shí)間，增加漂洗時(shí) 間，減少曝光時(shí)間。
七． 檢測(cè)
（1） 膠片曝光幾秒到數(shù)分鐘，具體情況要看膜上化學(xué)發(fā)光條帶明暗強(qiáng)度而定。膠片 曝光時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)照成膠片背景變深。沖洗膠片以確定所測(cè)抗原 的正確曝光時(shí)間。
（2） 沖洗膠片的步驟：曝光完的膠片先在顯影液中沖洗至出現(xiàn)條帶為止，一般在 1min 以內(nèi)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)照成膠片背景變深。再放入定影液中漂洗，十秒即可。 顯影液漂洗完后，要多用清水沖洗，以免定影液中成分殘留在膠片上。
